Cours : L'apoptose, une mort cellulaire programmée

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Généralités sur la mort cellulaire programmée ou Apoptose

Dans les organismes multicellulaires, les cellules qui sont sénescentes, devenues inutiles, ou potentiellement dangereuses sont détruites par un processus de suicide cellulaire fortement régulé appelé mort cellulaire programmée ou apoptose. Ce programme s’effectue par le biais de protéases, les caspases, qui déclenchent la mort cellulaire en dégradant des substrats cellulaires du noyau et du cytoplasme. Les caspases existent dans toutes les cellules sous formes de précurseurs inactifs (procaspases) dont l’activation d’un premier contingent de caspases dites initiatrices entraînent l’activation séquentielle des caspases dites effectrices notamment la caspase-3, au sein d’une cascade protéolytique. Le processus d’activation peut être initié par divers types de signaux intra- et extra-cellulaires. Deux voies principales d’activation sont actuellement identifiées : la voie extrinsèque des récepteurs à domaines de mort (Fas, TNF), et la voie intrinsèque mitochondriale. L’activation des caspases, et indirectement de tout processus apoptotique, est régulée par des membres d’autres familles
protéiques, en particulier la famille du proto-oncogène Bcl-2.

L’apoptose est donc un mécanisme régulateur essentiel qui intervient dans l’homéostasie tissulaire et dans divers processus physiologiques clés. Ainsi, tout dysfonctionnement de ce programme peut s’avérer délétère pour l’organisme et conduire au développement de diverses pathologies, en particulier le cancer.

1. Introduction – Aspects physiologiques de l’apoptose

Savez-vous que toutes les cellules qui constituent un organisme multicellulaire ont la capacité de se faire hara-kiri? Ce phénomène, que l'on nomme «mort cellulaire programmée» ou «apoptose», est nécessaire au développement et au maintien du bon fonctionnement d'un organisme vivant. L’ apoptose est donc un mécanisme régulateur essentiel qui intervient dans l’homéostasie cellulaire (l’homéostasie cellulaire est un équilibre entre prolifération et mort cellulaire), et constitue le type de mort cellulaire tout désigné pour l'élimination des cellules excédentaires ou «nuisibles». C'est une mort physiologique douce qui a un rôle essentiel notamment au cours du développement embryonnaire et foetal, dans l’organisation du système nerveux central, ainsi que dans l’élaboration du système immunitaire.

2. Définitions : Nécrose versus Apoptose

Il existe 2 types majeurs de mort cellulaire : la nécrose et l'apoptose (cf tableau comparatif).

La nécrose est une mort cellulaire dite "accidentelle" qui survient lors d'un dommage tissulaire et qui implique des groupes de cellules. Lors de la nécrose, la cellule gonfle puis la membrane cellulaire éclate déversant le contenu cellulaire dans le tissu environnant et provoquant localement une inflammation. Cette inflammation est provoquée par la présence d’enzymes et de substances inflammatoires présentent dans le cytosol. Les organelles (notamment les mitochondries et le noyau) restent intacts tout au long de ce processus.

L'apoptose découvert en 1972 au contraire est une forme « physiologique » de mort cellulaire, hautement régulée et qui est indispensable à la survie des organismes multicellulaires. Morphologiquement, l’apoptose correspond à une rétraction progressive de la cellule, avec condensation de la chromatine et du cytoplasme, suivie d'une fragmentation caractéristique de l'ADN aboutissant à la formation de fragments cellulaires ou corps apoptotiques (cf illustration). Les organites intracellulaires contenus dans les corps apoptotiques sont structurellement intacts. L'apoptose (du grec : chute des feuilles en automne, avec apo pour éloignement et ptose pour chute (description en 1972 par Kerr, Wyllie et Currie) donc signifie chute en se détachant) ressemble ainsi à une mitose abortive sans réplication, avec division de la cellule en multiples fragments conduisant à la perte de viabilité cellulaire. Les corps apoptotiques formés sont ensuite phagocytés par les macrophages ou des cellules épithéliales de voisinage normales; la formation de corps apoptotiques avec membrane plasmique intacte prévient le relargage des constituants intracellulaires et donc la réaction inflammatoire. En ce sens, l'apoptose doit être distinguée de la nécrose qui aboutit à l’éclatement de la cellule suivi d'une réaction inflammatoire locale.

La nécrose donne finalement l’image d’un phénomène anarchique et désordonné à caractère explosif, tandis que l’apoptose est un processus actif et bien contrôlé d’implosion cellulaire.

Différences entre apoptose et nécrose
Schéma décrivant l'apoptose et la nécrose

Principales différences entre apoptose et nécrose
Tableau décrivant les différences entre apoptose et nécrose


3. Déroulement de l’ apoptose

L’apoptose est une forme de mort cellulaire active qui nécessite la participation de la cellule pour sa propre mort par le biais d'événements intracellulaires qui sont en fait placés sous contrôle génétique (cf.infra). La découverte des familles de gènes et protéines impliqués dans le déroulement de l’apoptose et de sa régulation est venue de l’étude du développement d’un petit ver transparent : caenorhabditis elegans ou c.elegans.

De manière schématique un processus apoptotique peut-être décomposé en 3 phases successives :

Apoptose : le point de non retour
Après la phase effectrice : point de non retour. La cellule est amenée à être détruite.


Schéma récapitulatif des 3 phases de déroulement de l’apoptose. Si la cellule dépasse le point de non-retour, les caspases (enzymes) agissent et sont les protéines effectrice de l'apoptose qui dégrade les substances cellulaires.

a). Les signaux déclenchants l'apoptose au cours de la phase d’induction

La survie des cellules dépend de leur capacité à trouver dans leur environnement proche les signaux qui leur permettent de réprimer jour après jour le déclenchement de leur suicide. Ces signaux seront intégrés par la cellule qui en fonction de son génotype et de son état physiologique, orientera sa réponse soit vers la mort, soit vers la survie, la prolifération ou la différenciation cellulaire. Leur nature peut être très variable aussi bien physiologique que pathologique, intra- qu’extra-cellulaire (cf. tableau récapitulatif).

Facteurs de promotion et d'inhibition de la viabilité cellulaire
Tableau décrivant les facteurs de promotion et d'inhibition de la viabilité cellulaire


b) Phase effectrice ou d’exécution de l'apoptose

Cette phase d’exécution encore appelée phase effectrice se caractérise par l’activatio de protéines « carrefour » que sont les caspases (cysteinyl aspartate-specific proteinase). L’activation des caspases est commune à toutes les voies possibles de transduction du signal
inducteur. Il s’agit d’une phase régulable correspondant à l’intégration du signal apoptotique et des signaux inhibiteurs d’apoptose présents au sein de la cellule ou dans son milieu environnant.

Apoptose : point de non retour
Schéma décrivant le point de non retour d'une cellule


Les caspases sont capable de dégrader plus d’une centaine de substituts cellulaire

On a sur les photos précédentes :
- A : une cellule normale
- B : une cellule morte par apoptose (présence d’une diminution du volume cellulaire)
- C : phagocytose du corps apoptotique par macrophage (le « a » correspond à un corps apoptotique)
- D : cellule normale
- E : cellule en apoptose (condensation de la chromatine)
- G : cellule mort par apoptose (présence de compartiment périnucléaire de la chromatine = partie qui se sont crée à partir du noyau qui s ’est fragmenté.
- H : nécrose (remaniement du cytoplasme, gonflement des mitochondries)

c) Phase de destruction cellulaire et d’élimination

Suite à la phase effectrice, la cellule franchira ou non un point de non retour correspondant à l’étape où le processus apoptotique est enclenché de manière irrémédiable. Cette étape marque le début de la phase de destruction cellulaire avec les caractéristiques morphologiques et biochimiques précédemment décrites.

4) Structure et fonctions des caspases, les protéines effectrices de l’apoptose

L’apoptose est donc irréversiblement déclenchée par l’activation de protéases intracellulaires : les caspases (signifiant cystéinyl aspartate specificprotéinase), dont on dénombre actuellement chez les mammifères 14 membres.

a) Structure des caspases

Les caspases existent normalement dans la cellule sous forme de précurseurs inactifs appelés procaspases. Elles sont successivement activées en cascade, et leur activation conduit irrémédiablement la cellule à sa mort, avec les caractéristiques morphologiques et biochimiques précédemment citées.

Cellule en apoptose au microscope
Microscopies d'une cellule en apoptose
Caspase
Caspase


Les caspases active sont des tétramères constitué de 2 petites et grandes sous-unités.
Structure des caspases

On distingue :
- les caspases dites initiatrices / activatrices (caspase-8 et -9 et -10)
- et les caspases dites exécutrices / effectrices (caspase-3 mais aussi caspase-6 et caspase-7).

Actuellement, 14 caspases (nommé caspase 1 , caspase 2, caspase 3…) ont été découvert chez les mammifères donc on parle de familles de caspase. Il y a un rôle prépondérant de la caspase 3 quelque soit le signal apoptotique. On a des caspases active qui sont les premières caspase activé et qui vont activé les caspases effectrices (ex : la caspase 3 est une caspase effectrice)

Signal apoptotique et protéolyse
Signal apoptotique et protéolyse


b) Spécificité et fonctions des caspases

Les caspases clivent spécifiquement des substrats cellulaires après un résidu d’acide aspartique qui se situe en position P1 du motif tétrapeptidique P1-P2-P3-P4 reconnu. Comment agissent les caspases pour induire cette phase de dégradation cellulaire au cours de laquelle plus d’une centaine de cibles cellulaires seront dégradées ?

Les trois principales activités des caspases :

Apoptose
Apoptose


Pour 1, le principal composant concerné est la protéine ICAD. Lorsque ICAD est inactivé, l’ADN se fragmente à cause de l’activation des endonucléases.

Pour 2, on peut citer comme exemple de protéines qui interviennent dans le maintient et la réparation génomique (réplication et épissage), : protéine PARP, DNA-pKc6 ,V170 ? Rb et MDM2 , SREBP

c) Voies d’activation des caspases

Deux voies d’activation des caspases sont principalement identifiées :
- 1). la voie des récepteurs (Rc) à domaines de mort ou voie extrinsèque,
- 2). la voie intrinsèque ou mitochondriale.

1) La voie extrinsèque ou voie des Rc à domaines de mort.

Cette voie est activée en réponse à un signal externe, en l’occurrence la liaison de ligands à certains récepteurs spécifiques (ces Rc contiennent dans leur domaine intracytoplasmique un domaine de mort particulier appelé DD (death domain) appartenant à la famille du récepteur au TNF :

- Rc membranaires de la famille du TNF (TNF-R1 pour tumor necrosis factorrecpetor ; récepteur du facteur nécrosant des tumeurs),
- Rc Fas (APO/CD95) qui est l’un des Rc membranaires les plus importants de cette voie d’activation extrinsèque.

Ces Rc sont situés dans la membrane plasmique et contiennent des domaines particuliers appelés Death Effector Domain (domaines effecteurs de mort) au niveau de leur domaine intracellulaire. Ils permettent le recrutement et l’activation de caspase.

La fixation de ligands spécifiques au Rc TNF (TNFa) ou Fas-L sur le Rc Fas déclenche par des mécanismes particuliers l’activation en cascade de caspases.

Exemple d’activation de la voie Fas. Les lymphocytes cytotoxiques peuvent induire l’apoptose d’une cible (cellule infectée) en produisant Fas-L qui se fixera sur le Rc Fas. Lorsque le Rc Fas est activé par son ligand une molécule particulière dénommée FADD (Fas associated death domain protein ; protéine associée au death domain du Fas) est alors recrutée. Il s’agit d’une protéine adaptatrice car elle va jouer le rôle d’un adaptateur. En effet, FADD à son tour recrute des molécules de procaspase-8 et les agrègent entraînant leur activation en caspase-8 actives. Cette activation se fait par protéolyse. Les molécules de caspase-8 activées activent en aval d’autres caspases (les caspases effectrices) notamment la caspase-3 selon le processus en cascade précédemment expliqué. Le complexe formé par Fas/FADD/procaspase-8 est dénommé DISC (death-inducing signallins complex ; complexe de signalisation induisant la mort).

A noter : les interactions entre les différents constituants du DISC se font par le biais des fameux DED que l’on retrouve donc à la fois sur le Rc Fas, FADD et la procaspase-8.

Activation de l'apoptose de l'extérieur de la cellule (voie extrinsèque)
Activation de l'apoptose de l'extérieur de la cellule (voie extrinsèque)

Mécanisme d'induction de l'apoptose par le lymphocyte T cytotoxique
Mécanisme d'induction de l'apoptose par le lymphocyte T cytotoxique


2) La voie intrinsèque mitochondriale (signal d’origine intra-cellulaire)

Il s’agit d’une voie d’activation mise en jeu lorsque les cellules sont lésées ou soumises à un stress, et le signal inducteur est essentiellement d’origine intracellulaire (c’est une voie d’activation qui est sollicitée lorsque la cellule détecte un problème interne (dommages de l’ADN)). Dans cette voie d’activation les mitochondries sont « stimulées » et induisent alors la libération du cytochrome-c dans le cytosol. Une fois libéré dans le cytosol, le cytochrome-c va se fixer à une protéine adaptatrice équivalente à FADD de la voie extrinsèque : la protéine Apaf-1, et va l’activer. Une fois activée cette protéine Apaf-1 est capable de se lier à la procaspase-9. Il se forme alors un complexe trimoléculaire encore appelé « Apoptosome » constitué par le cytochrome-c/Apaf-1/procaspase-9 qui va permettre toujours par un mécanisme de protéolyse l’activation de la procaspase-9. La caspase-9 active pourra à son tour activer d’autres caspases et notamment la caspase-3.

Apoptose
Apoptose

Activation de l'apoptose de l'intérieur de la cellule (voie intrinsèque)
Activation de l'apoptose de l'intérieur de la cellule (voie intrinsèque)


Exemple d’activation et de régulation de la voie mitochondriale. Des lésions de l’ADN (signal intracellulaire) peuvent déclencher l’apoptose. Cette réponse nécessite généralement la protéine p53 (voir cours cycle cellulaire) qui active la transcription de gènes qui codent pour des protéines de promotion de la libération du cytochrome-c des mitochondries : la protéine Bax. Cette protéine appartient à la famille de Bcl-2 où son membre de référence Bcl-2 est connu au contraire pour empêcher le relargage du cytochrome-c, et réprimer les processus apoptotiques. C’est donc le ratio entre protéine pro- et anti-apoptotique de cette famille Bcl-2 qui conditionnera la libération du cytochrome-c, et le déclenchement d’un processus apoptotique.

Régulation de l'apoptose par BCL2/Bax
Régulation de l'apoptose par BCL2/Bax


Si Bcl2 est plus important en quantité que Bax alors il n’y a pas de formation d’apoptosome. Si Bax est plus important en quantité que Bcl2 alors on à une activation de l’apoptosome.  Les deux voies principales d’activation des caspases sont en fait organisées selon un même schéma, avec premièrement l’activation d’une caspase initiatrice (caspase-8 ou 10, caspase-9) nécessitant la participation d’une molécule adaptatrice (FADD ou Apaf-1), conduisant dans un second temps à l’activation des caspases effectrices (surtout la caspase- 3), au sein d’une cascade protéolytique.

Apoptose
Apoptose

Schéma récapitulatif des deux voies d’activations principales des caspases au cours de l’apoptose, et de leur interconnexion.

5. Rôles physiologiques de l’apoptose
a). Au cours du développement

C'est au milieu du siècle dernier que l'on reconnut que chaque organisme vivant, y compris l'être humain est composé de cellules et que ces dernières sont l'élément de base de la vie. Peu de temps après, on remarqua que certaines cellules mouraient de façon spécifique lors du développement normal d'un organisme. En effet, au cours de notre développement, les cellules sont produites en excès, puis selon des critères précis, certaines meurent afin de générer des structures particulières selon l’organe engendré. Le nombre de cellules est donc contrôlé par l’équilibre entre la prolifération cellulaire et la mort cellulaire par apoptose.

Apoptose
Apoptose


Illustration du principe d’équilibre entre prolifération et mort cellulaire au cours de l’homéostasie cellulaire

Au cours du développement embryonnaire, les cellules sont produites en excès, puis selon des critères précis, certaines meurent afin de générer des structures particulières selon l’organe à engendrer. L'un des premiers cas décrit fut celui du têtard qui perd sa queue lorsqu'il devient grenouille (cf illustration). Les cellules constituant la queue meurent les unes après les autres, selon un ordre précis et programmé. La mort des cellules provoque ainsi la disparition de l'organe inutile au stade adulte.

Apoptose et développement
Elimination des structures inutiles, des cellules produites en trop grand nombre.


Un autre exemple est celui de la morphogenèse des doigts qui implique l’apoptose des cellules de l’espace interdigital générées au début de l’embryogenèse. Dans l’expérience qui vous est ici présentée, des pattes de souris ont été prélevées à la fin de la vie embryonnaire et ont révélé des cellules apoptotiques à la fois dans les espaces interdigitaux et au niveau des futures articulations (à gauche en noir). A droite, les cellules bleues correspondent à celles qui expriment la caspase-3 activée.

Apoptose et développement
Les cellules exprimant la caspase 3 activée sont vouées à être détruites par apoptose

Illustration de la morphogenèse des doigts d’une patte de souris au début de l’embryogenèse.

Apoptose et développement
Différences entre les cellules produisant un signal de survie et celles qui sont destinées à mourir par apoptose

Un autre exemple est celui de la mise en place du système nerveux central où environ 85 % des neurones en formation dans le cerveau d'un embryon en développement (cf illustration) sont éliminés. Ce ménage est nécessaire, car le surplus de neurones provoquerait un bruit de fond nuisible au fonctionnement normal du cerveau.

Plus de 50 % des neurones en formationdans le cerveau deraient détruit par apoptose.

b). Apoptose et système immunitaire

Par ailleurs, la mort cellulaire par apoptose permet l'élimination des lymphocytes dysfonctionnels ou autoréactifs de notre système immunitaire. De même c'est encore un processus apoptotique qui est impliqué dans l'élimination des lymphocytes spécifiques produits après une infection, une fois que l’infection est enrayée. Dans ce cas de figure c’est la voie Fas qui est impliquée. Enfin, l'apoptose est le type de mort cellulaire utilisée par les lymphocytes T cytotoxiques pour entraîner des cellules infectées au suicide. Cette apoptose est induite par deux voies : voie Fas classique et système perforine/granzyme B (cf.schémas).

Apoptose
Apoptose
Perforine
Schéma d'une perforine

Le LT8 produit de la perforine qui crée des trous dans la membrane et permet ainsi le passage du granzyme (qui à a peu près le même rôle que les caspase)

Maladie asocié à un défaut de l'apoptose Maladie asocié à un excès de l'apoptose

CANCERS

- lymphomes folliculaires liés à une surexpression de BCL-2
- carcinomes avec mutation du gène P53
- tumeurs hormono-dépendants
(cancer du sein, des ovaires et de la prostate ----> génère des signaux de survie à la place de signaux d'apoptose)


SIDA
- destruction par apoptose des LT4 (= LT auxilliaire)

TROUBLES NEURO-DEGENERATIFS
- maladie d'Alzeimer, de Parkison (destruction
spécifique de neurones)
- Sclérose latérale amyoptrophique

MALADIE AUTO-IMMUNE
-lupus érythémateux disséminé (LED)
-disfonctionnement du système immunitaire car pas d'élimination de lymphocyte immunoréactif


ISCHEMIES (hypoxie général signal de mort cellulaire= déficit en O2)

-du myocarde (= infarctus)
-cérébral (=AVC)

HEPATITES FULMINANTES
- destruction massive de hépatocytes

Apoptose et système immunitaire.

Exemple de l’élimination d’une cellule infectée par le lymphocyte T cytotoxique.

En conclusion, l’apoptose apparaît essentielle à la construction, au maintien et à la réparation des tissus, mais aussi à l’élimination des cellules surnuméraires, dysfonctionnelles ou endommagées. Le suicide des cellules est donc placé sous un contrôle hautement spécifique et efficace.

6. Apoptose pathologique

L’importance de l’apoptose fait que toute dérégulation de ce processus peut être délétère pour l’organisme. Ainsi, une apoptose inappropriée peut contribuer au développement et à la progression de diverses pathologies, qu’elles soient liées à une inhibition de ce programme comme dans la majorité des cancers et les maladies auto-immunes; ou à un excès comme dans certaines dégénérescences du système nerveux (ex : maladie Alzheimer), et certaines maladies virales comme le SIDA.

Le LT8 produite de la perforine qui crée des trous dans la membrane et permet ainsi le passage du granzyme (qui à a peu près le même rôle que les caspase)
Exemple : les cancers.

Au cours d’un processus de cancérisation, il existe probablement des défauts de mise en route de l’apoptose lorsque surviennent des anomalies de l’ADN qui devraient normalement déclencher le programme de mort cellulaire : mutations de p53 (voir cours cycle cellulaire).

Par ailleurs, les cellules devenues cancéreuses ont acquis la capacité d'éviter l’apoptose en court-circuitant notamment les signaux produits par leur environnement. En effet, certains types de cellules cancéreuses se caractérisent par leur capacité à exprimer en grande quantité la protéine anti-apoptotique Bcl-2, bloquant ainsi l’activation potentielle de la voie mitochondriale en réponse à certains signaux apoptotiques pouvant être reçus : c’est le cas d’une hémopathie, le lymphome folliculaire.

D’autres cancers comme le mélanome, le plus dangereux des cancers cutanés, est constitué par des cellules qui évitent l’apoptose en inhibant le gène qui code pour Apaf-1, et donc en réprimant la voie d’activation mitochondriale.

Enfin, les cancers du côlon et les cancers pulmonaires élaborent des protéines leurres en concentration importante qui vont se lier à Fas-L, et l’empêcher ainsi de se combiner au RcFas afin d’activer la voie extrinsèque de l’apoptose. Pour d’autres pathologies, il existe au contraire un excès d’apoptose qui va entraîner la mort de populations cellulaires spécifiques. C’est le cas des lymphocytes T4 dans le SIDA, ou la destruction de neurones localisés dans des zones particulières du cerveau lors de certaines maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson)

Maladies associées à l'apoptose
Maladies associées à l'apoptose


Un processus cancérigène apparaît comme une maladie du suicide cellulaire où une cellule devient subitement indépendante des signaux de son environnement, et capable de résister aux mécanismes d’élimination par apoptose :

· phase d’immortalisation (surexpression de Bcl-2).
· Ce n’est que si d’autres altérations surviennent provoquant le dédoublement cellulaire (phase de prolifération ou de transformation cellulaire) que le processus cancéreux peut réellement se développer (anomalies du cycle cellulaire, mutation de p53).


Conclusion générale :

- L’apoptose peut être déclenchée par des stimulations internes mais aussi externes, dont la nature détermine la voie d’activation.
- La cellule dispose de plusieurs systèmes pour déclencher le programme de mort cellulaire programmée.
- Rôle central des mitochondries dans l’apoptose, hormis celui de fournisseur d’énergie.
- Perspectives thérapeutiques importantes pour les pathologies dues à un dysfonctionnement de l’apoptose.

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