Cours : COURS DE PHYSIOLOGIE VEGETALE II

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INTRODUCTION

Les êtres vivants sont des « systèmes ouverts» qui échangent de la matière et de l'énergie avec leur environnement. À partir d'eau et de sels minéraux, de carbone, d'azote et d'une source d'énergie, certains organismes sont capables de réaliser la synthèse des substances organiques (glucides, lipides, protéines, acides nucléiques, etc.) qui les constituent (Fig. 3.1) ; ce sont les organismes autotrophes, dits phototrophes ou photosynthétiques quand l'énergie est la lumière. Ces organismes sont essentiellement les procaryotes chlorophylliens : bactéries vertes, pourpres et cyanobactéries, et les eucaryotes chlorophylliens : mousses, fougères, euglènes, algues, gymnospermes et angiospermes. Les plantes sont des organismes phototrophes qui utilisent l'énergie de la lumière pour synthétiser leurs substances organiques directement à partir d'éléments minéraux. Elles sont également autotrophes au carbone, à l'azote et au soufre. En revanche, les organismes qui sont incapables d'effectuer eux-mêmes les synthèses de leurs constituants à partir d'éléments minéraux sont appelés hétérotrophes. Ces derniers, animaux, humains par exemple, utilisent pour leur croissance des substances organiques préexistantes d'où ils tirent l'énergie nécessaire au bon déroulement de la vie : processus de la respiration par exemple. La photosynthèse apparaît comme la fonction inverse de la respiration. La respiration est l'oxydation des composés organiques en présence d'O2 qui se traduit par la libération de CO2. La photosynthèse se manifeste à la lumière par une prise de CO2 (carbone inorganique), la synthèse de matière organique et un rejet de dioxygène. De la photosynthèse et de la respiration résultent un cycle pour le carbone et un cycle pour l'oxygène qui sont antiparallèles. Il faut rappeler que les organismes photosynthétiques respirent également ; la respiration restant la principale source énergétique la nuit.

Chapitre I : LA NUTRITION MINÉRALE

1. INTRODUCTION

La nutrition minérale de la plante intègre l'ensemble des mécanismes impliqués dans le prélèvement par les racines, le transport, le stockage et l'utilisation des ions minéraux nécessaires au métabolisme et à la croissance de la plante. Sur le plan fondamental, la fonction de nutrition minérale représente une originalité majeure du monde végétal. Dans les écosystèmes terrestres, les plantes représentent la principale voie d'entrée des ions minéraux nutritifs dans la biosphère et les chaînes alimentaires qui conduisent à l'homme. Autrement dit, ces ions quittent le monde minéral du sol pour entrer dans le monde vivant au moment précis où ils sont prélevés par les systèmes d'absorption de la membrane plasmique d'une cellule racinaire. On parle d'autotrophie à l'azote, au soufre, au fer, etc. Sur le plan appliqué, les connaissances acquises dans ce domaine sont utilisés pour gérer au mieux la fertilisation des cultures, de façon rationnelle sur le plan socio-économique et durable sur le plan écologique.

2. LES IONS NUTRITIFS ET LEURS FONCTIONS

Un des premiers objectifs des physiologistes de la nutrition minérale des plantes a été de préciser le statut, essentiel ou non, des éléments identifiés par l'analyse chimique dans les tissus végétaux.

2.1 Éléments essentiels, macro- et micro-éléments

Un élément est essentiel si, en son absence, la plante ne peut pas réaliser un cycle de développement complet, de la graine à la graine. Il est non essentiel dans le cas contraire. La mise au point de techniques de culture en hydroponie (culture où les racines baignent directement dans la solution nutritive, sans substratum solide) a permis d'identifier progressivement dix huit éléments essentiels classés en deux catégories, macro-éléments et micro-éléments selon leur abondance relative (Tab. 2.1). Les macro-éléments (outre C, H et O), sont N, K, Ca, Mg, P, et S (et la silice Si chez certaines espèces). Chacun d'entre eux représente au moins 0.1% de la matière sèche de la plante. L'azote N est prélevé du sol par les racines sous forme de nitrate (NO3-) ou d'ammonium (NH4+) ou provient chez certaines espèces de la fixation de l'azote atmosphérique par des bactéries symbiotiques. K, Ca, Mg, P et S sont prélevés du sol sous forme d'ions K+, Ca2+, Mg2+, phosphate (H2PO4-) et sulfate (SO42-). Les micro-éléments, Cl, Fe, Mn, Zn, B, Cu, Ni et Mo, sont prélevés sous forme de Cl-, Fe2+ ou Fe3+ (selon les espèces), Mn2+, Zn2+, borate (H2BO3-), Cu2+, Ni2+ et MoO42-. Dans les molécules (protéines, acides nucléiques, phospholipides, acides organiques …), l'oxygène génère des groupes porteurs de charges négatives (fonction carboxyle et groupe phosphate par exemple) et l'azote génère des charges positives (fonctions amines). Les valeurs de l'abondance relative de O et N fournies dans le tableau 2.1 indiquent que la quantité d'atomes d'oxygène est bien plus importante que celle d'atomes d'azote dans les biomolécules. De ce fait, ces molécules sont, dans leur ensemble, porteuses d'une charge électrique négative nette. Cette charge négative des molécules organiques est compensée électriquement par la présence de grandes quantités de cations inorganiques, K+, Ca2+ et Mg2+. Dans le cytosol, c'est essentiellement K+ qui remplit cette fonction de neutralisation électrique. Dans les parois cellulaires, c'est essentiellement Ca2+.

2.2 Le rôle des principaux éléments essentiels

a) Azote, soufre et phosphore

L'azote (N), le soufre (S) et le phosphore (P) présentent la caractéristique commune d'être intégrés dans les biomolécules par des liaisons covalentes. C'est par exemple le cas de l'azote et du soufre dans les acides aminés et les protéines, ou du phosphore dans les acides nucléiques ou les phospholipides (Tab. 2.2). L'azote et le soufre sont intégrés dans les molécules sous forme réduite, ce qui implique préalablement une réduction des ions nitrate et sulfate absorbés. Au contraire, P est présent dans la cellule essentiellement sous la forme oxydée (groupes phosphates). Les ions nitrate (NO3-), phosphate (H2PO4-/HPO42-) et sulfate (SO42-) absorbés peuvent également rester non métabolisés. Leur site de stockage principal est la vacuole. Par exemple, lorsque sa disponibilité dans le sol n'est pas limitante, l'ion nitrate (NO3-) est souvent accumulé en grande quantité dans la vacuole. Il participe ainsi au contrôle du potentiel osmotique et de la turgescence de la cellule. Les ions minéraux sont présents également dans le cytosol où leurs concentrations sont généralement stables. C'est le cas du phosphate qui présente une concentration relativement stable et contrôlée dans le cytosol, proche de 10 mmol.L-1. Cette stabilité ou « homéostasie » traduit le rôle essentiel du phosphate dans le métabolisme énergétique, la synthèse et l'hydrolyse des liaisons riches en énergie (par exemple l'ATP). Le phosphate participe également au pouvoir tampon du cytosol, dont le pH est stabilisé à une valeur proche de 7.2 à 7.4.

b) Potassium

Le potassium (K+) constitue le cation inorganique le plus abondant dans le cytosol de toute cellule, animale ou végétale. À ce titre, il participe au contrôle du potentiel osmotique, de la force ionique du cytosol et du potentiel électrique transmembranaire. En relation avec ces fonctions, il joue un rôle important, à la fois au niveau cellulaire et au niveau de l'organisme entier. Par exemple, chez les animaux, K+ est impliqué dans l'excitabilité cellulaire et la transmission de l'influx nerveux. Chez les plantes, il contrôle le potentiel hydrique et la pression de turgescence des cellules ; K+ est en conséquence impliqué dans le contrôle de l'élongation et de la croissance cellulaire, ou encore dans la régulation de l'ouverture stomatique et ainsi des échanges gazeux (CO2 et vapeur d'eau). L'évolution a probablement retenu K+ comme cation endocellulaire majeur. Pour les premiers organismes vivants, présents dans l'eau de mer, accumuler K+ et exclure Na+ (l'ion le plus concentré dans le milieu) a probablement constitué la solution la plus simple pour « énergiser » la membrane cellulaire, c'est-à-dire pour établir un déséquilibre de charges électriques de part et d'autre de la membrane, à l'origine d'une différence de potentiel électrique transmembranaire. Des raisons méthodologiques ont facilité l'analyse fonctionnelle et moléculaire du transport de K+ dans la plante. Cela est dû en particulier à l'existence de traceurs radioactifs (42K+ ou 86Rb+ Rubidium) et au fait que les flux transmembranaires de K+ sont très élevés, ce qui rend relativement aisée l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (électrodes endocellulaires). Aussi, à ce jour, les systèmes de transport de K+ sont très souvent parmi les systèmes de transport d'ions nutritifs les mieux caractérisés chez les plantes.

c) Calcium

La cellule utilise le calcium (Ca2+) en tant que cation divalent non toxique capable de former des complexes en s'associant fortement aux groupes ligands porteurs de résidus oxygène. La teneur moyenne de Ca2+ dans un tissu végétal peut être voisine de celle de K+ mais sa répartition est très différente. Quantitativement, Ca2+ est essentiellement présent dans la paroi cellulaire et dans la vacuole. Il est par contre très faiblement présent dans le cytosol (sa concentration est 105 à 106 fois plus faible que celle de K+ dans ce compartiment). Dans la paroi, Ca2+ est associé aux groupes carboxyles des hémicelluloses et composés pectiques qu'il stabilise. Il joue ainsi un rôle de structuration du squelette pariétal, contrôlant sa plasticité. Dans la vacuole, il participe à la neutralisation électrique d'anions inorganiques (sulfate, phosphates).

d) Magnésium

Avec le magnésium (Mg2+), la cellule dispose d'un cation bivalent de petite taille, très mobile, fortement électropositif et préférant s'associer par liaison ionique à des ligands très nucléophiles, tels que les groupes phosphates. Dans le cytoplasme, il s'associe en particulier à l'ATP : le complexe ATP-Mg constitue le substrat effectif des enzymes à activité ATPasiques telles que les ATPases pompes à H+ qui énergisent le plasmalemme. Une autre fonction de Mg2+ est sa participation à la constitution des pigments chlorophylliens.

e) Les micro-éléments

Les micro-éléments qui jouent un rôle structural dans les protéines sont impliqués dans l'activité de co-facteurs enzymatiques et/ou participent à des réactions d'oxydo-réduction dans la cellule. C'est le cas du fer (Fe) impliqué dans les complexes protéiques Fe-S des photosystèmes, les cytochromes et les ferrédoxines. Le cuivre (Cu) participe également au transfert d'électrons en photosynthèse. Le cuivre est lié également au fonctionnement de la cytochrome oxydase de la chaîne respiratoire et de la superoxyde dismutase (SOD), enzyme de détoxification des formes actives de l'oxygène. Le manganèse (Mn) joue un rôle déterminant dans le système d'oxydation de l'eau constitutif du photosystème II. Les carences en bore (B) sont connues pour perturber le transport des minéraux et des sucres. Le molybdène (Mo) est indispensable au fonctionnement de la nitrate réductase.

2.3 Interactions entre éléments minéraux et nutrition minérale

Il existe entre les éléments minéraux des interactions qui font que l'action de l'un est modifiée par la présence d'un autre. On parle de synergie entre deux éléments quand l'effet de l'un est amplifié par la présence de l'autre. On parle d'antagonisme quand l'effet de l'un est atténué par la présence de l'autre. Le nitrate NO3- facilite par exemple l'absorption du potassium K+. En revanche, une absorption importante de potassium K+ entrave l'absorption de magnésium Mg2+. Les antagonismes Mg2+/Ca2+ sont également bien connus.

2.4 Effet de la variation des ressources minérales sur la croissance

Une représentation typique de la croissance d'une plante, exprimée en % de la croissance maximale, en fonction de la ressource en un nutriment quelconque est donnée (Fig. 2.1). Cette courbe présente un palier optimal entre l'insuffisance pour les faibles concentrations et l'excès pour les fortes concentrations. L'insuffisance peut se traduire par des carences et l'excès par des toxicités. La carence se manifeste par une limitation de croissance, se traduisant par des baisses de rendement. La carence en azote, par exemple, qui entraîne une baisse importante de la productivité, peut être contrecarrée par l'apport d'engrais azotés. La partie optimale de la courbe en fonction de la concentration en nutriments se traduit par un plateau. La concentration minimale en nutriments qui permet une croissance maximale est appelée point critique. Au-delà de ce point, on observe une augmentation de la concentration de l'élément dans la plante (dans la vacuole notamment) qui ne bénéficie pas à la croissance ; on parle de consommation de luxe. À dose plus élevée en nutriment, on peut observer un ralentissement de croissance, correspondant à une toxicité. Il faut rappeler également que l'absorption des ions par les plantes dépend de nombreux facteurs : • de la nature, concentration, de la disponibilité et des interactions entre ions dans le sol ; • de la nature (présence de colloïdes chargés), de la structure, du pH et de la température du sol ; • de l'âge et de l'état physiologique de la plante, de l'activité biologique de la rhizosphère, etc. Les solutions de sol très légèrement acides sont généralement favorables à l'absorption des ions par les végétaux. La présence, en revanche, d'un excès de calcium en alcalinisant le milieu peut perturber l'assimilation du fer et empêcher la synthèse de chlorophylle ce qui se traduit par des tâches jaunes sur les feuilles, symptôme appelé chlorose ferrique.

3. VOIES DE TRANSPORT DES IONS MINERAUX

Les ions et l'eau sont distribués à tous les organes de la plante par les tissus vasculaires, xylème et phloème, qui représentent des structures très performantes pour le transport à longue distance. Les ions, comme l'eau, peuvent également diffuser librement, sur de plus courtes distances, au travers de tissus vivants non spécialisés, en empruntant les voies apoplastique (continuum des parois cellulaires au sein d'un tissu) et symplastique (continuum des cytoplasmes via les plasmodesmes). En revanche, du fait de leur charge, les ions ne peuvent quasiment pas diffuser librement au travers de la bicouche lipidique des membranes cellulaires et leur transport y est contrôlé de manière très stricte. Ainsi, les contributions respectives des différentes voies (apoplastique, symplastique et éventuellement transcellulaire peuvent être foncièrement différentes dans le cas du transport de l'eau et dans celui du transport des ions.

3.1 Tissus vasculaires et voies symplastique et apoplastique

Si le transport des ions via les sèves pour les échanges inter-organes est important, les voies apoplastique et symplastique peuvent représenter des voies de transport très significatives pour les ions au sein du moins de certains organes comme la racine. La voie symplastique, empruntant les continuités cytoplasmiques ménagées entre les cellules par les plasmodesmes, permet la circulation des ions de cellule à cellule dans un même tissu sans traverser de membranes. La paroi pecto-cellulosique des cellules végétales qui constitue la voie apoplastique, représente également une voie de passage de faible résistance pour de nombreuses substances. Toutefois, les propriétés physico-chimiques de la paroi, sa capacité à échanger des ions par exemple, l'hydrophobicité de certains de ses composés comme la subérine créent des conditions de transport ou de rétention spécifiques pour chaque ion. En règle générale, on admet que les ions peuvent pénétrer dans la paroi et en ressortir réversiblement sous l'effet des seules forces physiques de diffusion et d'échange. La paroi oppose peu de résistance à la migration des ions mobiles comme K+, Cl-, NO3-, H2PO4-. En revanche, certains cations comme Ca2+, Cu2+, Al3+ peuvent se fixer fortement et s'immobiliser sur les sites électronégatifs des hémicelluloses et composés pectiques de la paroi. Les membranes biologiques, par exemple le plasmalemme ou le tonoplaste, sont des membranes essentiellement lipidiques, hydrophobes. Elles constituent des barrières à la diffusion, empêchant le libre échange des ions entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule et entre compartiments cellulaires. La diffusion à travers le plasmalemme et le tonoplaste serait très lente si elle n'était accélérée par des systèmes de transport facilitant leur passage.

3.2 Transport radial dans la racine

À l'interface du sol et de la racine, les ions minéraux de la solution extérieure peuvent diffuser librement et pénétrer dans les parois cellulaires des cellules de l'épiderme (appelé rhizoderme) (Fig. 2.2). Ils peuvent alors migrer radialement, en empruntant la voie apoplasmique, vers les cellules internes. Dans ce trajet vers la stèle racinaire, ils rencontrent cependant deux barrières, l'exoderme et l'endoderme. Ces couches cellulaires constituent des barrières à la diffusion des ions parce que leurs parois radiales s'imprègnent de composés hydrophobes (subérisation) imperméables aux ions, formant une structure appelée cadre de Caspary. L'exoderme résulte de la différenciation de la première couche cellulaire sous le rhizoderme (appelée hypoderme lorsqu'elle n'est pas différenciée et subérisée). La barrière exodermique est présente chez la plupart des espèces à partir d'une certaine distance de l'apex. La barrière endodermique, qui constitue la limite entre le cortex et la stèle de la racine, est présente chez toutes les espèces. L'endoderme se différencie très vite au-dessus de l'apex racinaire (à environ 1 cm de l'apex chez le maïs), L'exoderme se différencie plus lentement (à une dizaine de cm chez le maïs). Cependant, une situation de stress accélère la mise en place de l'exoderme, ce qui indique que cette barrière joue un rôle important dans l'adaptation de la racine à son environnement. Lorsque le milieu extérieur est relativement dilué (ce qui est le cas de la plupart des sols), la fonction d'absorption est principalement le fait des cellules rhizodermiques. Les cellules corticales semblent peu contribuer à cette fonction, même en absence de rhizoderme, sauf lorsque les concentrations dans le milieu sont élevées et que les ions nutritifs sont drainés par un flux d'eau rapide dans les parois racinaires, dû à une transpiration importante des feuilles. L'endoderme constitue une barrière très efficace à la migration des ions dans l'apoplasme. Cela signifie qu'à ce niveau le transfert vers la stèle doit forcément emprunter la voie symplastique. Autrement dit, les ions encore présents dans l'apoplasme à ce niveau ne peuvent progresser vers la stèle que s'ils sont absorbés par une cellule de l'endoderme et entrent ainsi dans le symplasme. Les ions du milieu ne peuvent donc atteindre la stèle qu'en se soumettant à un contrôle du plasmalemme et de ses systèmes d'absorption. L'endoderme joue ainsi un rôle crucial dans le contrôle de la physiologie de l'absorption racinaire (sélectivité ionique de l'absorption).

3.3 Transport axial vers les parties aériennes

À l'issue de leur transport radial dans la racine, après avoir franchi la barrière endodermique, les ions sont sécrétés dans l'apoplasme de la stèle au voisinage du xylème puis diffusent dans les vaisseaux xylémiens où ils sont entraînés par le flux de sève pour être distribués à tous les organes aériens de la plante. Il faut noter que la sortie des ions du symplasme vers le xylème (espace apoplastique) nécessite le franchissement du plasmalemme d'une cellule. Cette sortie est permise et contrôlée par des transporteurs spécifiques.

4. TRANSPORT PASSIF, TRANSPORT ACTIF ET DIFFERENTS TYPES DE SYSTEMES DE TRANSPORT

L'activité des systèmes de transport membranaire est analysée selon deux points de vue, thermodynamique ou mécanistique. L'analyse thermodynamique s'intéresse à la nature de la source d'énergie et aux mécanismes de couplage énergétique impliqués dans le transport des ions au travers des membranes. L'analyse mécanistique s'intéresse aux modes de fonctionnement des systèmes de transport, par exemple à la façon dont la perméation du substrat est réalisée, au niveau moléculaire.

4.1 Critères thermodynamiques de classification des systèmes de transport

a) Transports actifs et passifs : formalisme du transport

L'énergie d'un ion i dans un compartiment donné est définie par son potentiel électrochimique µi (exprimé en J.mol-1) qui dépend essentiellement de la concentration (Ci) de cet ion dans ce compartiment, de sa valence (z), et du potentiel électrique (i) auquel se trouve ce compartiment. • Le passage d'un ion i d'un compartiment 1 à un compartiment 2, par exemple de la solution du sol au cytosol d'un poil absorbant racinaire, est dit passif lorsqu'il s'effectue dans le sens d'une diminution du potentiel électrochimique de cet ion, autrement dit quand l'énergie de l'ion est plus faible dans le compartiment d'arrivée que dans le compartiment d'origine. • Le transport est dit actif lorsque l'énergie de l'ion est au contraire plus forte dans le compartiment d'arrivée que dans le compartiment d'origine. Le transport actif s'effectue dans le sens d'une augmentation du potentiel électrochimique de l'ion. L'expression du potentiel électrochimique de l'ion i dans un compartiment quelconque est donnée par la relation : µi = µ0 + RT. ln Ci + zFi où µ0 désigne le potentiel électrochimique standard de l'ion, R la constante des gaz parfaits, F la constante de Faraday et T la température (°K) (Ci et i définis plus haut). Lorsque l'ion i passe du compartiment 1 au compartiment 2, la variation de son énergie est égale à la différence :  µi = µi2 - µi1 =  µ0 + RT. ln Ci2 + zF2 -  µ0 + RT. ln Ci1 + zF1 = RT. ln (Ci2/Ci1) + zF. (2- 1) Cette relation indique que la variation d'énergie  µi lors du passage de l'ion i d'un compartiment à l'autre dépend uniquement du rapport de concentration entre les deux compartiments et de la différence de potentiel électrique existant entre ces compartiments. - Le transport est passif lorsqu'il s'effectue dans le sens d'une variation de potentiel électrochimique décroissante ( µi < 0). - Le transport est actif dans le cas contraire ( µi > 0). - Lorsque la variation d'énergie associée au transport de l'ion i à travers la membrane est nulle ( µi = 0), l'ion est dit à l'équilibre thermodynamique. Dans ce cas, l'existence d'une différence de concentration entre les deux compartiments résulte d'une différence de potentiel électrique entre ces deux compartiments, et les termes RT. ln (Ci2/Ci1) et zF. (2- 1) se compensent. La relation obtenue, ou relation de Nernst, s'écrit : Ci2/Ci1 = exp -zF (2- 1)/RT  = 2- 1 = - RT/zF. ln (Ci2/Ci1) À la température de 25°C, en utilisant les logarithmes de base 10, la relation devient :  = EN = - 60/z. log (Ci2/Ci1) Dans cette situation d'équilibre, la différence de potentiel électrique () correspond au potentiel de Nernst (ou EN). Pour un ion monovalent, la relation de Nernst prédit qu'une différence de potentiel de – 60 mV entre deux compartiments correspond à un rapport de concentration C2/C1 de 10. Des valeurs de potentiel de – 120 mV, -180 mV ou – 240 mV correspondent respectivement à des rapports de concentration de 100, 1 000 ou 10 000. Pour illustrer la signification de cette relation, et montrer l'importance du potentiel électrique transmembranaire dans le transport des ions dans les cellules, prenons l'exemple du prélèvement de l'ion K+ par une racine dans un sol. Supposons que la concentration cytosolique de K+ soit de 100 mmol.L-1, ce qui représente l'ordre de grandeur habituel, et que la concentration de l'ion dans la solution du sol soit de 100 µmol.L-1, ce qui correspond à une concentration suffisante pour la plante, en principe non limitante pour sa croissance. La concentration de K+ est donc 1 000 fois plus élevée dans le compartiment d'arrivée (le cytosol) que dans le compartiment de départ (le sol). • Si la différence de potentiel électrique entre le sol et le cytosol du poil absorbant de la racine est voisine de – 180 mV, valeur couramment observée, la relation de Nernst indique que cette valeur est identique au potentiel de Nernst :  = EN = - (60/1). log 103 = - 180 mV. C'est la valeur du potentiel d'équilibre thermodynamique pour cet ion. Autrement dit, si les mouvements de l'ion sont passifs, il n'y a aucun flux net d'ion dans la racine. • Si, en revanche, le potentiel électrique du cytosol est moins négatif que – 180 mV (par exemple – 130 mV), le transport de l'ion, du sol vers le cytosol de la cellule du poil absorbant racinaire, est nécessairement actif ( > EN). Le transport peut être au contraire passif si ce potentiel est plus négatif que – 180 mV ( < EN). Il faut noter que des valeurs de potentiel pouvant atteindre – 200 à – 250 mV sont couramment observées pour le plasmalemme chez les plantes (Fig. 2.3). Cela signifie que, thermodynamiquement, les cellules végétales peuvent absorber le K+ du sol de façon passive, même à des concentrations relativement faibles (inférieures à 10 µmol.L-1). Il a été observé, que l'absorption des anions nutritifs (nitrate NO3-, phosphates HPO42-, H2PO4-, sulfate SO42-) est presque toujours active, d'une part parce que ces ions sont souvent moins concentrés dans le sol (µmol.L-1) que dans le cytosol (mmol.L-1), et d'autre part parce que le potentiel électrique négatif du cytosol les repousse. En effet, on constate en règle générale qu'il existe un  négatif entre le cytosol et le milieu.

b) « Énergisation » de la membrane et des transports

Lorsque le transport est actif, l'ion est pris en charge par un système de transport qui transfère de l'énergie à l'ion pour le faire passer d'un côté à l'autre de la membrane, à un potentiel énergétique plus élevé dans le compartiment d'arrivée que dans celui de départ. Deux types de système de transport sont capables de réaliser un transport actif, les pompes ioniques primaires et les systèmes de transport secondaires ou co-transport. Les pompes ioniques tirent leur énergie directement de l'hydrolyse de molécules riches en énergie (ATP). Les systèmes de co-transport impliquent un couplage énergétique entre une pompe ionique primaire qui transporte activement un ion (généralement des protons) et un transporteur qui assure à la fois le retour passif de l'ion délocalisé par la pompe et le transport actif d'un autre ion. Ces systèmes de co-transport sont appelés transports actifs secondaires.

c) « Énergisation » du plasmalemme

La cellule végétale énergise le plasmalemme en utilisant de l'ATP comme source d'énergie, grâce à des enzymes membranaires appelées ATPases pompes à protons, appartenant à la classe des ATPases dites de type P. Ici, P signifie phosphorylation car ces pompes passent par un état phosphorylé à chaque cycle d'hydrolyse d'ATP. Ces pompes hydrolysent l'ATP qui fournit l'énergie nécessaire au transport de protons (H+) du cytosol vers le milieu extérieur. Ce transport requiert de l'énergie parce qu'il s'effectue dans le sens d'une augmentation du potentiel électrochimique de H+ (µH+ > 0) (Fig. 2.4). La circulation des H+ à travers l'ATPase se traduit par l'installation d'une différence de pH (pH) et d'une différence de potentiel électrique () « aux bornes de l'ATPase », c'est-à-dire de part et d'autre de la membrane. Puisque ce sont des charges électriques positives (H+) qui se déplacent du cytosol vers le milieu extérieur, le cytosol acquiert un potentiel électrique négatif par rapport au milieu. Il existe de fait une différence de potentiel électrique fortement négative entre apoplasme (ou milieu extérieur) et cytosol. Une toxine fongique, la fusicoccine, active ces ATPases en interagissant avec ces mécanismes. Ces ATPases pompes à H+ sont fortement représentées dans le plasmalemme des cellules périphériques, favorisant ainsi le pompage de nutriments à partir du sol.

d) « Énergisation » de la membrane vacuolaire

Le tonoplaste est énergisé selon le même principe que le plasmalemme. Deux types de pompes à protons contribuent à l'installation du gradient de potentiel électrochimique de H+, des ATPases dites de type V (pour vacuolaire), et des pyrophosphatases qui tirent leur énergie de l'hydrolyse du pyrophosphate (P-Pi). Comme cela a été expliqué dans le cas du plasmalemme, le fonctionnement des pompes à protons permet la création d'un gradient de potentiel électrochimique de H+ de part et d'autre du tonoplaste entraînant l'établissement d'une différence de potentiel électrique et d'une différence de pH. Ainsi, l'intérieur de la vacuole est à un potentiel électrique plus positif que celui du cytosol (quelques dizaines de millivolts) et le pH vacuolaire est également plus acide (pH < 6) que celui du cytosol (pH = 7.2 à 7.4) (Fig. 2.5). Il existe donc un gradient de H+ entre la vacuole et le cytoplasme qui joue un rôle fondamental pour les transports actifs secondaire au niveau du tonoplaste. Le franchissement du tonoplaste par les anions peut être favorisé par la différence de potentiel membranaire entre la vacuole et le cytosol (vac - cyt) qui est légèrement positive. En revanche pour les cations, cette différence de potentiel constitue thermodynamiquement un handicap. Les ATPases pompes à H+ de type V sont assez comparables aux ATP synthases présentes dans les membranes mitochondriales et chloroplastiques (ATPases de type F ou ATP synthases). Dans le cas de ces ATPases, le passage des H+ est associé à une rotation de l'enzyme. Toutefois, signalons que les ATPases pompes à H+ de type V, en hydrolysant de l'ATP pour permettre un transfert des H+ dans la vacuole, catalysent une réaction inverse de celle opérant lors de la respiration ou de la photosynthèse. L'activité des ATPases de type V est sensible à l'ion nitrate (NO3-) et à une toxique fongique, la bafilomycine, qui peuvent l'inhiber. Les ATPases de type P du plasmalemme sont quant à elles bloquées par le vanadate, un analogue du phosphate inorganique, Pi.

e) Théorie chimio-osmotique appliquée à l'énergisation des transports : transport actif secondaire.

D'un point de vue thermodynamique, les processus de transports à travers une membrane, par exemple le plasmalemme, impliquent des systèmes de transport actif primaires qui hydrolysent des liaisons riches en énergie pour excréter un ion, en général H+ chez les plantes et Na+ chez les animaux, contre son potentiel électrochimique. Ce transport crée puis maintient une différence de potentiel électrochimique de cet ion à travers la membrane, avec une composante électrique (le cytosol est à un potentiel électrique négatif) et une composante dite « osmotique » (l'ion étant plus concentré sur la face externe que sur la face interne de la membrane). Ce phénomène « énergise » la membrane. Des systèmes de transport secondaires, fonctionnant en uniport ou co-transport, permettent le transport des solutés à travers la membrane. Un uniport permet le transport d'un soluté dans le sens d'une diminution de son potentiel électrochimique à travers la membrane. Ce transport est énergisé indirectement par la différence de potentiel électrique de part et d'autre de la membrane. Un système de co-transport couple le retour spontané dans le cytoplasme de l'ion utilisé pour énergiser la membrane (H+ ou Na+) au transport d'un autre soluté contre son potentiel électrochimique. Il s'agit d'un symport si les deux substrats, le soluté et H+ (ou Na+), sont transportés dans le même sens, et d'un antiport si les deux substrats sont transportés en sens contraire. Par exemple, il existe sur le plasmalemme des cellules végétales des systèmes de symport H+ : NO3- pour l'absorption active de nitrate, et des systèmes d'antiport H+/Na+ pour la ré-excrétion active des ions Na+ (Fig. 2.6).

4.2 Critères mécanistiques de classification des systèmes de transport

Il est commode de définir trois types de systèmes de transport : les pompes ioniques, les canaux et les transporteurs ; ces deux derniers types de système étant dépourvus d'activité d'hydrolyse. • Une pompe ionique est définie comme un système de transport dont le fonctionnement implique l'hydrolyse, à chaque cycle de transport, d'une liaison covalente (appartenant à une molécule riche en énergie, ATP par exemple). • Un transporteur est un système qui passe par un changement conformationnel à chaque fois qu'il transporte un substrat (ou co-transporte deux substrats). La protéine fixe son substrat sur une face de la membrane et, suite à un changement conformationnel, l'emmène sur l'autre face où elle le libère. • Un canal est un système qui passe d'un état inactif à un état actif, et réciproquement, suite à des changements conformationnels, conduisant à l'ouverture ou la fermeture d'un pore aqueux. Lorsqu'il est ouvert, les ions (auxquels le canal est perméable) migrent (passage facilité) dans le pore aqueux, d'un côté à l'autre de la membrane, sans qu'il y ait de changement conformationnel à chaque fois qu'un ion traverse le pore. Les évènements qui déclenchent l'ouverture ou la fermeture du pore du canal sont de divers types, par exemple une variation du potentiel électrique de part et d'autre de la membrane ou la fixation d'un ligand. Il en résulte que la vitesse de transport d'un ion dans un canal peut être très élevée (de l'ordre de 107 ions transportés par seconde), au moins 1 000 fois plus grande que dans le cas d'un transporteur. Il faut savoir cependant que la distinction entre transporteur et canal n'est pas aussi tranchée qu'on l'avait initialement supposé.

4.3 Aperçu général des différents modes de transport des ions dans les membranes plasmique et vacuolaire

La figure 2.7 fournit une représentation schématique des différents systèmes de transport du plasmalemme et du tonoplaste : pompes ioniques primaires, transporteurs et canaux. Le plasmalemme renferme au moins deux catégories d'ATPases de type P qui fonctionnent comme des pompes ioniques, des ATPases pompes à H+ et des ATPases pompes à Ca2+. Les ATPases pompes à H+ constituent le système d'énergisation essentiel de la membrane, en générant un fort gradient électrochimique de H+. Les ATPases pompes à Ca2+ interviennent principalement dans le maintien de l'homéostasie du calcium cellulaire et permettent ainsi de réduire les teneurs en Ca2+ libre dans le cytosol. La membrane vacuolaire ou tonoplaste renferme deux catégories de pompes à H+, les ATPases de type V et les pyrophosphatases, qui catalysent toutes les deux un transport vectoriel de H+ du cytosol vers le lumen de la vacuole. Les gradients de H+ générés par les H+-ATPases permettent le fonctionnement de systèmes de transport spécifiques dits actifs secondaires, qui couplent le retour exergonique de H+ le long de son gradient de potentiel électrochimique au transport à contre-gradient électrochimique de composés chargés (ions minéraux et organiques) et neutres (saccharose). Il existe par exemple dans le plasmalemme des cellules végétales des systèmes de symport H+ : NO3- pour l'absorption active du nitrate, et des systèmes d'antiport H+/Na+ pour la ré-excrétion active des ions Na+ entrés en excès dans le cytoplasme de plantes vivant en milieu salin (dû à une forte concentration de Na+ dans le sol). Dans les membranes plasmique et vacuolaire existent également de nombreux canaux responsables du transport des cations et anions. Des canaux cationiques ont été identifiés, en particulier les canaux sélectifs du K+ (canaux Shaker) ou des canaux perméables à Ca2+ et Na+. Plusieurs canaux anioniques ont été mis en évidence par des approches électrophysiologiques, révélant une perméabilité au nitrate NO3-, chlorure Cl-, sulfate SO42-, phosphates PO43-, HPO42-, H2PO4- et/ou malate. Il faut noter aussi que la vacuole joue un rôle majeur dans le stockage des ions minéraux et organiques, du fait de son volume et de son équipement en systèmes de transport. Sa fonction de stockage est illustrée par le fait que les concentrations vacuolaires en ions minéraux comme K+ et NO3- peuvent varier très largement, de quelques mM à plus de 100 mM, selon que la plante se trouve en situation de carence ou d'excès, alors que les concentrations de ces ions dans le cytosol sont maintenues relativement stables dans ces différentes situations. Par ailleurs, certains acides organiques comme l'acide malique peuvent être présents à des concentrations élevés (plusieurs dizaines de mM), leur forme anionique (basique) servant notamment de contre-ions aux cations minéraux comme K+. Certains éléments minéraux peuvent être stockés sous forme de composés insolubles. Citons par exemple les phytates, des molécules organiques polyphosphatées qui représentent des formes majeures de stockage du phosphore dans les vacuoles des grains notamment. Cet élément est mobilisé sous forme de phosphate au cours de la germination. Enfin la vacuole peut séquestrer des produits toxiques (herbicides, métaux lourds …) et les empêcher ainsi de nuire au fonctionnement de la cellule. Les transporteurs ABC ; Il existe chez les plantes un groupe de protéines de transport qui appartiennent à la grande famille des protéines possédant une cassette spécifique de liaison à l'ATP (« ATP-binding cassette » ABC en anglais). Ces protéines sont impliquées dans le transport d'une grande variété de substrats allant de certains ions aux macromolécules (flavonoïdes, anthocyanes, produits du métabolisme secondaire …). Notons enfin que les membranes plasmique et vacuolaire des cellules végétales possèdent des systèmes de transport membranaire qui par leur structure sont homologues à ceux rencontrés chez d'autres organismes, eucaryotes animaux, fongiques et procaryotes.

5. LES PLANTES ET L'AZOTE

Par rapport à leur masse de matière sèche, l'azote est le quatrième élément nutritif important des plantes. C'est un constituant essentiel des protéines, des acides nucléiques, des hormones, de la chlorophylle et d'une foule de composés primaires ou secondaires des plantes. La plupart des plantes puisent l'essentiel de leur azote dans le sol, soit sous la forme de nitrate (NO3-) ou d'ammonium (NH4+), mais l'approvisionnement en azote du sol est limité si bien que vis-à-vis de l'azote disponible, les plantes entrent en compétition avec toute une série des microorganismes. Il en résulte que l'azote est souvent un facteur limitant dans les écosystèmes naturels ou cultivés. La plus grande partie de l'atmosphère, 78 % en volume, est constitué de diazote (N2), un gaz incolore et inodore. Cependant, malgré son abondance, les plantes supérieures sont incapables de convertir le diazote en une forme biologiquement utilisable. Les deux atomes du diazote sont reliés par une liaison exceptionnellement stable NN et les plantes ne possèdent pas l'enzyme capable de rompre cette liaison. Seules certaines espèces procaryotiques sont capables d'effectuer cette réaction importante. Cette situation pose aux plantes un problème particulier concernant l'absorption et l'assimilation de l'azote ; les plantes dépendent d'organismes procaryotiques pour convertir le diazote atmosphérique en une forme instable qu'elles puissent utiliser.

5.1 Le cycle de l'azote

L'azote est généralement réparti dans trois ensembles principaux : l'ensemble constitué par l'atmosphère, le sol (et l'eau qui lui est associée) et l'azote contenu dans la biomasse. Les échanges complexes entre ces trois ensembles sont connus sous le terme de cycle de l'azote. Au centre du concept du cycle de l'azote (Fig. 6.1) se trouve l'azote contenu dans le sol. L'azote du sol pénètre dans la biomasse surtout sous la forme de nitrate (NO3-) qui est absorbé par les plantes et les microorganismes. Une fois assimilé, l'azote nitrique est converti en azote organique sous la forme d'acides aminés, et d'autres composés azotés qui constitueront les protéines ainsi que d'autres macromolécules. L'azote continue son chemin dans la chaîne alimentaire, lorsque les animaux mangent les plantes. Puis l'azote retourne au sol sous la forme de déchets animaux, ou lors de la mort et la décomposition des différents organismes.

a) Ammonification, nitrification et dénitrification

Au cours de la décomposition, l'azote organique est transformé en ammoniac (NH3) par une série de microorganismes. Ce processus est connu sous le terme d'ammonification (Fig. 6.1). Une partie de l'ammoniac peut être volatilisé et retourne dans l'atmosphère, mais la plus grande partie est recyclé en nitrate (NO3-) par des bactéries du sol. La première étape de la formation de nitrate, est l'oxydation de l'ammoniac en nitrite (NO2-) par des bactéries appartenant aux genres Nitrosomonas ou Nitrococcus. Le nitrite est ensuite oxydé en nitrate par des membres du genre Nitrobacter. Ces deux groupes bactériens sont dits bactéries nitrifiantes, le résultat de leur activité est la nitrification. Les bactéries nitrifiantes sont chimioautotrophes ; ce qui signifie que l'énergie libérée par l'oxydation des matières inorganiques telles que l'ammonium ou le nitrite est utilisée pour convertir le dioxyde de carbone en carbone organique. En prélevant l'azote dans le sol, les plantes entrent en compétition avec des bactéries dénitrifiantes (ex : Thiobacillus). Lors de cette réaction de dénitrification, ces bactéries réduisent le nitrate en diazote, qui retourne à l'atmosphère. Les quantités d'azote qui retournent à l'atmosphère par dénitrification représenteraient de 93 à 190 millions de tonnes par an.

b) La fixation de l'azote

La perte d'azote par dénitrification est largement compensée par la transformation de l'azote atmosphérique en des formes combinées ou fixées. La réaction de réduction du diazote en ammoniac est appelée fixation de l'azote. Environ 10 % de l'azote fixé annuellement provient des oxydes d'azote de l'atmosphère. Les éclairs et la lumière ultraviolette transforment l'azote en oxydes d'azote (NO, N2O). Les autres sources d'oxydes d'azote atmosphérique, proviennent des combustions industrielles, des feux de forêt, des gaz d'échappement et des centrales électriques. 30 % de la quantité totale d'azote fixé, sont également produits par la fixation industrielle de l'azote. Ce procédé industriel (de Haber-Bosch) provoque la combinaison de l'azote et de l'hydrogène à des températures et des pressions élevées (300 à 400 °C et 35 à 100 MPa). La fixation industrielle de l'azote est un procédé coûteux et dépend étroitement des combustibles fossiles, autant pour la fourniture d'hydrogène (gaz naturel) que pour l'énergie nécessaire pour atteindre les températures et les pressions requises. L'essentiel de l'azote fixé industriellement est destiné, sous forme d'engrais, à des usages agricoles. A l'échelle mondiale, le reste de l'azote fixé, environ 60 %, est représenté par la réduction de l'azote en ammoniac par des organismes vivants. Ce processus est connu sous le terme fixation biologique de l'azote.

5.2 La fixation biologique de l'azote

Les plantes sont des organismes eucaryotes, caractérisés par la présence d'un noyau limité par une enveloppe. Les organismes eucaryotes sont incapables de fixer le diazote parce qu'ils ne possèdent pas la machinerie biochimique appropriée. Les bactéries et les cyanobactéries sont des procaryotes ; leur matériel génétique n'est pas enclos dans un organite limité par une enveloppe. La fixation d'azote est l'apanage du domaine des procaryotes simplement parce qu'ils possèdent un complexe enzymatique, nommé dinitrogénase, qui catalyse la réduction de l'azote en ammoniac. Les procaryotes qui fixent l'azote, nommés fixateurs d'azote, comprennent à la fois des organismes libres et des organismes, qui forment des associations symbiotiques avec d'autres organismes.

a) Les fixateurs libres de l'azote

Les bactéries libres fixatrices d'azote, sont très répandues. Elles habitent les sédiments marins ainsi que ceux d'eau douce, les sols, les surfaces des feuilles et des écorces ainsi que le tube digestif de divers animaux. Bien que certaines espèces, soient aérobies (ex : Azotobacter), la plupart d'entre elles ne fixent l'azote que dans des conditions anaérobies ou des conditions de très faible pressions partielles d'oxygène (conditions dites de micro-aérophyllie). Elles comprennent des genres non photosynthétiques (Clostridum, Bacillus) et des genres photosynthétqiues (Rhodospirillum). En plus de ces bactéries, plusieurs genres de cyanobactéries (Anabaena, Nostoc) comprennent des espèces fixatrices d'azote.

b) Les fixateurs symbiotiques

Plusieurs associations symbiotiques fixatrices d'azote sont connues, elles englobent les associations bien connues entre différentes espèces bactériennes et les légumineuses. Quelques unes de ces associations figurent dans le tableau 6.1. Dans les associations symbiotiques, la plante représente l'hôte et le partenaire bactérien le symbionte. La forme la plus commune d'association symbiotique provoque la formation sur la racine (ou parfois sur la tige) de la plante hôte, de structures multicellulaires hypertrophiées, nommées nodules (Fig. 6.2). Chez les légumineuses (L'ordre des légumineuses est répartis en trois familles selon la nouvelle classification : les Mimosaceae, les Ceasalpiniaceae et les Fabaceae), le symbionte est une bactérie appartenant à l'un des trois genres : Rhizobium, Bradyrhizobium ou Azorhizobium. L'ensemble de ces organismes est désigné sous le terme de rhizobiums. Les rhizobiums sont subdivisés en espèces et en sous-espèces nommées biovars (une variété biologique) d'après l'espèce hôte (Tab. 6.1). La plupart des rhizobiums ne forment de nodules qu'avec un petit nombre de plantes hôtes, alors que d'autres sont très spécifiques et n'infectent qu'une seule espèce hôte. Des nodules sont également observés chez certaines espèces non légumineuses comme le piment royal (Myrica gale), le filao (Casuarina), quelques membres de la famille des Rosaceae et certaines graminées tropicales. Cependant dans les nodules de ces non légumineuses, le symbionte est une bactérie filamenteuse (Frankia) qui fait partie du groupe des actinomycètes. Les rhizobiums et Frankia vivent libres dans le sol, mais ils ne fixent l'azote que dans des associations symbiotiques avec une plante hôte appropriée.

5.3 La fixation biologique d'azote chez les légumineuses

La fixation symbiotique d'azote chez les légumineuses implique des interactions anatomiques, morphologiques et biochimiques importantes entre la plante hôte et les microorganismes qui l'envahissent. Il est généralement admis que les fixateurs d'azote symbiotiques apportent au sol, une quantité d'azote nettement plus importante que ne le font les bactéries libres. Il existe plus de 17.000 espèces de légumineuses. 90 % des espèces étudiées forment des nodules.

a) Infection et développement du nodule

La séquence des évènements qui débutent par l'infection bactérienne et qui se terminent par la formation d'un nodule différencié fixant l'azote, a été très étudiée chez les légumineuses, d'abord sous l'angle morphologique, puis plus récemment sous un angle biochimique et de génétique moléculaire. Globalement, le processus met en jeu des interactions multiples entre la bactérie et les racines hôtes. En effet, les rhizobiums et les racines du futur hôte nouent un dialogue sous la forme de messages chimiques entre les deux partenaires. Nous examinerons ces évènements en le regroupant en quatre stades principaux : 1. Multiplication des rhizobiums, colonisation de la rhizosphère et fixation aux cellules épidermiques et aux poils absorbants. 2. La courbure caractéristique des poils absorbants, l'invasion par les bactéries et la formation d'un cordon d'infection. 3. L'initiation du nodule et son développement dans le cortex de la racine. Stade généralement nommé stade 1. 4. Déversement des bactéries du cordon d'infection et différenciation de cellules spécialisées dans la fixation de l'azote (Fig. 6.3). * Le stade précoce – colonisation et initiation du nodule En présence des racines de l'hôte, la multiplication des bactéries et la colonisation de la rhizosphère sont accrues. L'attraction des bactéries par les racines des plantes hôtes semble d'abord impliquer un chimiotactisme positif (un mouvement vers un stimulant chimique). On sait que les racines exsudent une foule d'acides aminés, de glucides et d'acides organiques qui peuvent servir de nutriments aux rhizobiums. Après avoir colonisé la rhizosphère, les rhizobiums commencent à synthétiser des signaux moléculaires morphogènes appelés facteurs de nodulation, ou facteurs nod (des lipo-chitino-oligosaccharides). Les facteurs nod sécrétés dans la solution du sol par les rhizobiums, induisent de nombreux changements importants de la croissance et du métabolisme des racines de l'hôte qui précèdent l'invasion des poils absorbants par les rhizobiums puis le développement du nodule. Ces modifications (Fig. 6.3A), comprennent une production accrue de poils absorbants et le développement de racines plus courtes et plus épaisses. Les poils absorbants dont la reprise de croissance est stimulée par les facteurs nod, se ramifient et se recourbent en crosse à leur extrémité. Avant d'envahir leur hôte, les rhizobiums émettent également des signaux mitogènes qui stimulent la division de cellules du cortex ; ces cellules en division forment le méristème primaire du nodule (Fig. 6.3A). Un second centre de division apparaît dans le péricycle. Ces deux masses de cellules en division pourront éventuellement fusionner pour former le nodule complet. * Invasion du poil absorbant et cordon d'infection Lors du deuxième stade de la nodulation, la bactérie doit traverser la paroi de la cellule hôte de façon à entrer dans l'espace situé entre la paroi et le plasmalemme. Les bactéries percent partiellement la paroi cellulaire en libérant des enzymes telles que pectinases, cellulases et hémicellulases. Lorsque les rhizobiums ont atteint la face externe du plasmalemme, la croissance du poil absorbant cesse et la membrane plasmique commence à s'invaginer. Il s'ensuit la formation dans la cellule, d'une invagination en forme de tube, nommée cordon d'infection qui renferme les bactéries (Fig. 6.3B). Le cordon d'infection s'allonge jusqu'à ce qu'il atteigne la base du poil absorbant. Pendant que le cordon d'infection passe du poil absorbant au cortex, les bactéries continuent de se multiplier. Lorsque le cordon atteint le nodule en développement, il se ramifie de sorte que de nombreuses cellules du jeune nodule sont infectées (Fig. 6.3C). * la libération des bactéries Le stade final du processus infectieux est atteint lorsque les bactéries sont ‘déversées' dans la cellule hôte. En fait la membrane du cordon infectieux bourgeonne, formant de petites vésicules chacune contenant une ou plusieurs bactéries. Peu après leur ‘libération', les bactéries cessent de se diviser, grandissent et se différencient en cellules spécialisées dans la fixation d'azote, nommées bactéroïdes. Les bactéroïdes restent entourés d'une membrane, nommée membrane péribactéroïdienne. Le processus infectieux se poursuit durant toute la vie du nodule. Lorsque, suite à l'activité du méristème nodulaire, la taille du nodule augmente, les bactéries continuent à envahir les nouvelles cellules formées. De même lorsque le nodule s'accroît et atteint sa maturité, des connexions vasculaires s'établissent avec le système vasculaire de la racine (Fig. 6.5). Le rôle de ces connexions vasculaires est d'importer dans le nodule le carbone issu de la photosynthèse et d'exporter l'azote fixé vers les autres parties de la plante.

5.4 Biochimie de la fixation d'azote

a) La dinitrogénase

La fixation du diazote est catalysée par un complexe enzymatique nommé dinitrogénase. Seules les cellules procaryotes sont capables de fixer le diazote principalement parce qu'elles sont les seules à posséder le gène qui code pour cette enzyme. La dinitrogénase est un complexe protéique composé de deux protéines de taille différente (Fig. 6.6). La protéine la plus petite appelée protéine à fer a une masse moléculaire de 24 à 36 kD, selon l'espèce bactérienne. La plus grande protéine est appelée protéine MoFe a une masse moléculaire de 220 kD. Chaque protéine MoFe contient deux ions molybdène sous la forme d'un cofacteur fer-molybdène-soufre. La réaction globale de la réduction du diazote en ammoniac est décrite dans l'équation suivante : N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi Notez que le principal produit de la fixation biologique de l'azote est l'ammoniac, mais pour chaque molécule de diazote réduite, une molécule d'hydrogène est générée. La réduction du diazote se déroule en deux temps. Lors de la première étape, la protéine Fe est réduite par un donneur primaire d'électrons, la ferrédoxine. La ferrédoxine est une petite protéine (de 14 à 24 kD) contenant un groupement fer-soufre. Les électrons sont transportés par le fer, qui peut se trouver soit à l'état de fer ferreux réduit (Fe2+) soit à l'état de fer ferrique oxydé (Fe3+). Il est intéressant de noter que la ferrédoxine participe non seulement à la fixation de l'azote, mais qu'elle est aussi un transporteur d'électrons important dans la photosynthèse. Lors de la seconde étape, la protéine Fe réduite transfère les électrons à la protéine MoFe, qui catalyse à la fois la réduction du diazote gazeux et la production d'hydrogène.

b) Le coût énergétique de la fixation d'azote

La réduction biologique du diazote, comme la fixation d'azote par les procédés industriels est extrêmement coûteuse en terme d'énergie. Le nombre de molécules d'adénosine triphosphate (ATP) nécessaires permet de mesurer le coût énergétique. Pour chaque molécule de diazote réduite, au moins 16 ATP sont nécessaires, deux par électron transféré. Néanmoins, le coût global de la fixation biologique de l'azote doit également tenir compte du besoin en ferrédoxine réduite. On a estimé que le potentiel réducteur utilisé dans la réduction de l'azote est équivalent à au moins 9 molécules d'ATP supplémentaires, ce qui porte l'investissement total à au moins 25 molécules d'ATP par molécule de diazote fixée.

c) Dinitrogénase et oxygène

L'un des problèmes les plus cruciaux auxquels les organismes fixateurs d'azote doivent faire face est la sensibilité de la dinitrogénase à l'oxygène moléculaire (O2). Les protéines Fe et MoFe sont rapidement inactivées de façon irréversible par O2. Cette sensibilité extrême de la dinitrogénase à l'O2 pose un problème aux organismes fixateurs d'azote. Les grandes quantités d'énergie requises (sous la forme d'ATP et de réducteurs) sont produites dans la chaîne respiratoire cellulaire qui ne fonctionne efficacement qu'en présence d'O2. Comment les organismes résolvent-ils donc la contradiction entre les exigences de la chaîne respiratoire qui a besoin d'O2 et de la dinitrogénase qui y est sensible ? Dans les nodules des légumineuses, l'apport d'O2 est régulé en grande partie par une protéine qui lie l'O2 : la léghémoglobine. La léghémoglobine, synthétisée par la plante hôte, est localisée dans les cellules hôtes infectées par les bactéroïdes. La léghémoglobine peut constituer jusqu'à 30 % des protéines de la cellule hôte et confère au nodule une couleur rose caractéristique lorsqu'une partie coupée est exposée à l'air. La léghémoglobine est structurellement semblable à l'hémoglobine du sang des mammifères. Sa fonction est également similaire puisqu'elle lie l'O2 et contrôle sa libération dans la région contenant les bactéroïdes. Dans la zone renfermant les bactéroïdes, une concentration équilibrée d'O2 est maintenue à un niveau qui permet à la fois la respiration des bactéroïdes et la production d'ATP et de réducteurs, mais qui, en même temps empêche l'inactivation de la dinitrogénase par un excès d'O2.

6. SYMBIOSES MYCORHIZIENNES ET FIXATRICES D'AZOTE

6.1 Endomycorhize et ectomycorhize

La nutrition minérale des plantes est très améliorée par l'établissement d'une symbiose appelée mycorhization, associant racines et champignons. Une mycorhize (du grec myco ; champignon et rhiza ; racine) (association à bénéfices mutuels) est considérée comme un « nouvel organe » associant, physiquement et dans une relation symbiotique, les tissus périphériques d'une racine au mycélium d'un champignon. Les mycorhizes manifestent de grandes capacités de prélèvement de l'eau et des éléments minéraux (phosphore et azote notamment) au bénéfice de la plante hôte. En retour, la plante fournit aux champignons des composés organiques issus de la photosynthèse. Cette symbiose concerne 95% des espèces végétales. Elle se rencontre dans tous les écosystèmes, chez les plantes ligneuses comme chez les plantes de grande culture. Seules quelques familles végétales, comme les crucifères, ne sont pas mycorhizées en conditions naturelles. La généralité de cette association « champignons-phanérogames » en fait un phénomène biologique majeur des écosystèmes terrestres. Les structures générées par l'association mycorhizienne peuvent être classées sur la base de critères anatomiques, morphologiques et physiologiques. Les endomycorhizes à arbuscules et les ectomycorhizes sont les associations mycorhiziennes les plus répandues chez les plantes. Le préfixe endo fait référence au fait que les hyphes franchissent les parois et « repoussent » la membrane plasmique des cellules hôtes, sans pour autant pénétrer le protoplaste, c'est-à-dire sans traverser la membrane plasmique. Le préfixe ecto traduit le fait que les hyphes mycéliennes progressent strictement entre les cellules du cortex racinaire, au niveau de la lamelle moyenne, sans jamais sortir de l'apoplasme (Fig. 2.13).


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