Contaminations et Cross-contamination

i. Les problèmes de contaminationLes contaminants (bactéries, levures, champignons, mycoplasmes…) sont introduits par :- l’opérateur- l’atmosphère- la surface de travail- les solutions utilisées- …et bien d’autres sourcesii. Les sources de contaminationsIl existe plusieurs origines de contaminations possibles :- Dans le Milieu.- Dans le sérum.- La vaisselle.- La lumière.- Autoclave.- Entreposage.- Incubateurs non nettoyés.- Poussières et spores dues aux particules présentes dans l’air de la pièce et à la circulation des personnes.- Réfrigérateurs non nettoyés.- Hottes non nettoyées / Filtres des hottes non vérifiés.- Importation d’autres laboratoires de lignées cellulaires contaminées.- Négligence humaine.iii. Types de contaminationsa) Contaminants biologiques1) Bactéries – Levures - ChampignonsLa contamination peut être visible à l’oeil nu.La croissance rapide de ces micro-organismes (surtout en absence d’antibiotique) permet de les détecter en peu de temps :Licence en Biotechnologie et Pathologie Humaine Page 2 La présence ou non d’un trouble et d’une variation de pH. Mort cellulaire.Il faut obligatoirement faire une vérification au microscope :- Bactéries : milieu trouble, diminution de pH- Levures : milieu trouble, peu de changement de pH- Champignons : milieu limpide, augmentation du pH1.1) Levures, MoisissuresLes levures, comme les bactéries, ne collent pas aux cellules, elles flottent en suspension. Cependant, il existe toutes sortes de levures ayant des caractéristiques différentes.Leur croissance est lente et la formation de spores, propagée par la ventilation à l’intérieur de l’incubateur, peut causer un cauchemar pour les utilisateurs. On sait quand ça commence, mais on ne sait pas quand ça fini. On en sait encore moins la cause.Bien des choses sont en cause : milieu, sérum, trypsine, PBS, pipette, boîtes de Pétri, incubateur, mauvaise manipulation, pipetman, pipetaid, etc.Consigne :Soit on jette tout, soit on teste le premier accusé (milieu complet -PBS). On pourrait déposer une aliquote dans un milieu propice aux levures et mettre celles-ci : un à 37°C, un à 30°C.1.2) BactériesLes contaminations bactériennes sont plus faciles car moins contagieuses. Les bactéries sont mobiles, ont des formes définies, poussent rapidement, elles troublent et acidifient rapidement le milieu de culture.Contrôle de l’absence de bactéries et de champignonsLe milieu de culture cellulaire ne doit pas être trouble, ni acide (indicateur coloré).1.3) VirusTrop petits pour être détectables. Plusieurs donnent un effet cytotoxique (mort des cellules)Source : Le sérum peut contenir des virus bovin.1.4) ProtozoairesLa plupart sont unicellulaires, tels que les amibes. Certains peuvent former des spores.Certains ont un effet cytotoxique (cellules détruites en moins de 10 jours).Source : poussière, saleté, air, occasionnellement des tissus (tissu de gorge…).2) MycoplasmesLes mycoplasmes sont les plus dévastateurs et les plus répandus des contaminants. On les surnomme les cancers des cellules.Il existe des formes filamenteuses ou en forme de coques.Aucun signe visible lorsqu’on observe les cellules, sauf dans le cas où elles meurent.Plus de 20% des cultures cellulaires sont infectées aux mycoplasmes.Source :→provient souvent du sérum→du manipulateur (poumon via les mains)→d’autres cellules qui viennent d’ailleursLes effets peuvent se faire sentir à long terme, ils ont la capacité d’affecter leur cellule hôte dans la plupart de leur fonctionTraitement :Bien que les mycoplasmes soient résistants à certains antibiotiques, ils sont assez sensibles aux antibiotiques appartenant à la famille des cyclines (BM-cycline, MRA). Le traitement doit rester une alternative exceptionnelle.b) Les autres cultures cellulairesLe plus répandu de ces cas est sans doute la cellule HeLa.Des chercheurs ont démontré qu’environ 25% des cellules humaines sont contaminées par les cellules de types HeLa.Prévention :→bien désinfecter la hotte entre chaque type cellulaire, idéalement, on suggère d’attendre 20 minutesc) Contaminants chimiquesIls peuvent être une source de variabilité des résultats. Ions métalliques, endotoxines et autres impuretés du milieu, du sérum ou de l’eau. Qualité du plastique jetable (pétris, tubes, bouteilles). Radicaux libres et peroxyde d’hydrogène présents dans le milieu.Dépôt de matière sur le verre ou sur les pipettes causé par un reste de détergent, résidu qui vient du papier aluminium. Résidu de germicides ou pesticides utilisés lorsqu’on désinfecte les incubateurs, comptoirs ou autres instruments. Impureté de CO2 de l’incubateur.iv. Stratégie de contamination Prévenir les autres utilisateurs, surtout ceux qui partagent le même incubateur. Vérifiez tous les ingrédients individuellementCONCLUSION :La règle générale est que des cultures contaminées doivent être détruites par autoclavage et le milieu éliminé après addition d’eau de Javel.TRAITEMENT en cas d’urgence :- Bactéries : Différents antibiotiques- Levures et champignons : Antifongiques- Mycoplasmes : Anti-mycoplasmiquesCross-contaminationElle est due à la présence de plusieurs lignées simultanément sous la hotte et au temps de doublement très court de certaines lignées (exemple : HeLa)- Manipuler 1 lignée à la fois sous la hotte- Ne jamais replonger une pipette usagée dans une bouteille de milieu ou de trypsine.- Ajouter d’abord le milieu dans les boîtes puis les cellules et fermer les boîtes de culture- Ne pas ouvrir simultanément des bouteilles différentes et des flacons de cellules différentes sous la hotte